Матеріали та методи дослідженьМатеріали / Активність ферментів енергетичного обміну ембріональних трансплантатів / Матеріали та методи досліджень
Робота виконана на 110 статевозрілих самцях кролів, яких було розділено на 5 груп. Першій групі тварин (28 кролів) виконано аллотрансплантацію ембріональної очеревини, другій (28 кролів) -- алотрансплантацію ембріональної шкіри. Кожній тварині пересаджено 3 препарати ембріональної тканини на незашиту рану тонкої кишки за загальноприйнятою методикою. Третю групу (контроль) склали тварини які утримувалися за стандартних умов віварію (12 кролів), четверту -- тварини, яким виконано ентеротомію за прийнятою методикою з однорядним швом рани кишки (12 кролів). Тваринам 5-ї групи (30 кролів) пересаджено ембріональні остеобласти в кісткову рану.
Тварини виводились з експерименту шляхом пропускання електричного струму через спинний та довгастий мозок. Експерименти проводились у відповідності до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях.
Тварин оперували під комбінованим дом'язовим наркозом. Виконували повздовжню ентеротомію (1,5-2,0 см). Рану кишки або залишали відкритою, або зашивали вузловими серозно-м'язовими однорядними повздовжніми швами [Мазур Ю. І., 1996].
Донорами ембріональних тканин і клітин слугували ембріони самки кроля кінця другого - початку третього тижня вагітності. З черевної стінки ембріона сепарували препарати шкіри та м'язово-очеревинного пласту, котрий у подальшому умовно називали очеревиною. Препарати діаметром 1,5-2,0 см фіксували швами поверх рани тонкої кишки.
Для виділення остеобластів використовували росткові зони трубчатих кісток кінцівок трьохтижневого ембріона кроля. Під мікроскопом МБИ-6 при чотирьохразовому збільшенні в умовах темного поля локалізували росткові зони кісток і висікали їх [Созанский О.А. и др., 1998]. Одержаний матеріал гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при 200 об/хв у трьох вертикальних ходах. Для одномоментної трансплантації використовували 200-300 мг клітинної суспензії [Дибас Б.В., 1996].
У подальшому досліджували препарати отримані з ембріональних тканин (очеревина, шкіра) та клітин (остеобласти) до та після алотрансплантації, а також препарати отримані з тонкої кишки реціпієта.
Виділення мітохондріальної та цитоплазматичної фракції здійснювали за методикою диференційного центрифугування [Johnson D., Lardy H.,1967].
Активність лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), сукцинатдегідрогенази (СДГ, КФ 1.3.99) визначали методом [Eщенко Н.Д., 1982], малатдегідрогенази (МДГ, КФ 1.1.1.37) - згідно [Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г., 1982], глюкозо - 6 - фосфатдегідрогенази (Гл -6- ФДГ, КФ 1.1.1.49) - згідно [Путилин Ф.Е., Зоидзе С.Д., 1982], визначення активності кислої фосфатази (КФ, КФ 3.1.3.2) проводили з використанням стандартних наборів реактивів „LACHEMA” (Чехія).
Визначення кількості піровиноградної кислоти в тканинах здійснювали за методом [Czok R., Lamprecht W., 1970]. Вміст молочної кислоти в тканинах визначали згідно з [Hohorst H., 1970].
Гістологічні препарати забарвлювали гематоксилін-еозином за загальноприйнятою методикою [Ромейс В., 1953] й вивчали під світловим мікроскопом.
Статистичну обробку результатів досліджень проводили згідно зі загальноприйнятими методами варійційної статистики за допомогою пакету прикладних програм STATGRAFICS, а також з використанням факторного та кластерного аналізу [Харман Г., 1972, Лакин Г.Ф., 1990].